技术〡 分子检测在甲状腺癌中的意义

一、BRAF基因简介

Braf蛋白为RAS-RAF-MEK-ERK信号通路中上游调节因子，通过这些信号通路将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，进而调节细胞的生长、增值、分化，抑制细胞的凋亡。

正常的B-raf蛋白的功能是传递来自细胞膜的信号，通常只在需要传递信号时保持活性状态。但是，当BRAF基因发生突变后，突变的B-raf则一直保持活性状态，持续激活ERK信号，诱导细胞增殖，从而引起肿瘤的发生（图一）。B-raf基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道，如黑色素瘤、肺癌、肠癌、以及甲状腺癌，因此BRAF V600E是确定的致癌突变。

80%的BRAF基因突变发生在激酶功能域V600E（即外显子15）。

图一： BRAF基因突变导致肿瘤的发生

二、甲状腺癌的BRAF基因突变情况

    甲状腺癌的发病率在头颈部恶性肿瘤中居首位，约占全身恶性肿瘤发病的1%.近些年来，甲状腺癌的发病率一直呈现上升趋势，已经由过去的10/100万上升至如今的40/100万。

    甲状腺主要包括乳头状甲状腺癌(PTC)在甲状腺癌中占80%；滤泡状甲状腺癌(FTC)占甲状腺癌的10-15%；未分化甲状腺癌(ATC)约占甲状腺癌的2%；甲状腺髓样癌(MTC)约占甲状腺癌的3%。

PTC中40%-60%的肿瘤会发生 BRAFV600E突变。在典型的乳头状及高细胞甲状腺癌、1/3的髓样癌和未分化癌中都被证实有 BRAF基因突变。

三、BRAF基因突变检测在甲状腺癌中的意义

      (1) BRAF基因突变与甲状腺癌预后的关系

一项多学科的研究表明，BRAF与淋巴结转移，甲状腺外扩散，疾病晚期（III期和 IV期）及癌复发密切相关（图二）。之前还认为，BRAF基因突变与 PTC复发后与放射碘亲和力的缺失密切相关，致使放射性碘 131治疗抵抗。 在国际多中心学科中，研究结果也说明了 BRAF基因突变与甲状腺乳头状癌死亡率密切关系。

   图二： BRAF基因突变与甲状腺癌多发病灶、腺外侵犯及淋巴结转移的关系

      （2）BRAF基因突变对FNAB诊断的意义　　

FNAB（甲状腺细针穿刺）是目前推荐的甲状腺癌术前诊断的方法，由于穿刺细胞量少，因此也有一定的局限性。对于良性的患者仍有1-3%的患者后期随访发现为恶性结节。有10-30%的患者无法进行确诊，对这些患者往往进行局限的外科手术，例如甲状腺腺叶切除术，术后对切除的结节进行病理诊断20-25%的患者为甲状腺癌，需要二次手术进行甲状腺全切除术，而其余75%-80%的良性患者则接受了不必要的手术。15-40%的BRAF阳性的病人被诊断为不确定型或无诊断结果；有些样本细胞学检测结果为良性，但是BRAF结果为阳性的病人，手术之后检测结果为乳头状癌。一项综合分析表明，BRAF基因突变检测在诊断PTC方面的特异性可以达到99.8%（图三），因此BRAF的检测可以用于甲状腺癌的辅助诊断。因此，将BRAF检测用于FNA细胞学检测不确定型样本是非常有帮助的。

图三：BRAF基因突变检测对PTC诊断具有高特异性

    2011年甲状腺杂志上一篇前瞻性的研究提出了对FNAB不能确诊的患者的治疗策略，建议进行BRAF突变检测，如果突变阴性6-12后再穿刺检查，如为阳性则确定为恶性，并进行全甲状腺癌切除及中央淋巴清扫术，与2012年美国甲状腺年会推荐的策略相同。

     (3)BRAF基因突变检测与靶向药物治疗的关系

 2013年 12月 22号美国食品及药物管理局（FDA）批准索拉菲尼为治疗局部复发或者转移、放射碘抵抗的进展期DTC（400mg，一日两次）。有研究显示BRAF突变阳性患者使用索拉菲尼患者生存期更长，提示BRAF基因检测可预测患者使用索拉菲尼的疗效。甲状腺癌患者检测BRAFV600E可以为潜在肿瘤的进展及将来是否使用选择 BRAFV600E靶向治疗阻滞剂提供重要的信息。

　四、甲状腺癌中其余基因突变

RET 基因定编码一种跨膜的 RET，是目前发现的一种相对特异的 TC 基因。RET 基因重排在甲状腺肿瘤生成中扮演着重要角色，其重排与人种、地域差异，特别是辐射史等都有重要意义。对于一个细胞学不确定的标本，如果 RET显示阳性就需要甲状腺全切（如同 BRAF阳性）。由于 RET与典型变异 PTC的区域淋巴结转移相关，故 RET阳性对判断预后提供益处（如同 BRAF阳性）。

RAS基因是一种原癌基因，包括 3 类密切相关的成员，即 K-ras、H-ras 及 N-ras。ras 途径介导的对细胞外信号应答调控着细胞增殖、分化和凋亡过程。甲状腺肿瘤有 40% 出现 ras 点突变，其中绝大多数见于H-ras 和 N-ras 的第 61 位密码子，且主要发生于甲状腺滤泡状癌中。文献报道，N-ras 即第 61 密码子的突变在滤泡状腺癌中占优势，且与恶性程度相关。因此，检测 ras 基因有助于滤泡状 TC 的明确诊断。Hara 等发现N-ras 基因 61 位氨基酸突变（glu→arg）在 PTC 中发生率为 14.3%，其中病变局限者突变发生率为 4.8%，而伴广泛转移者突变发乍率为 27.8%，故认为 N-ras 第 61 密码子突变对 PTC 预后判断具有一定临床指导意义。

Pax8-PPAR 是甲状腺特异性转录因子 Pax8 和配体应答性核内受体型转录因子 PPAR 的重组产物。有报道证实甲状腺滤泡状癌的一个亚型中存在 t（2；3）（q13；p25）的基因易位，导致 Pax8 和 PPARγ1 的 A-F 区DNA 融合。Pax8-PPARmRNA 及其蛋白产物在甲状腺滤泡状癌的检出率为 62.5%，而滤泡状腺瘤、乳头状癌及结节性甲状腺肿均为阴性。有研究报道 Pax8-PPARγ1 基因重排是甲状腺滤泡癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）发生的一种分子途径，Psx8-PPARγ1 重排有助于提高并可能提前预示 FTC 的诊断。

鉴于分子检测在甲状腺癌肿的重要意义，2012年美国内分泌第94届年会在甲状腺结节的处理流程中也推荐了分子检测（图五)。对于结节首先进行FNAB的检查，良性的进行随访，不能诊断的进行复诊，仍不能确定的以及滤泡状病变可进行分子诊断，包括BRAF、RAS、RET等，如BRAF及RET阳性则确诊为恶性，进行甲状腺全切及劲中央区淋巴结清扫。如为阴性则进行随访并在此进行FNAB，但国内医生对于不确定的仍进行手术，致使很多患者接受不必要的手术。对于可疑及恶性的也要进行分子检测，阳性依然是甲状腺全切及淋巴区清扫，阴性的则只进行甲状腺切除。结合推荐及实际，目前可行的方式为只有确诊良性的患者不需要进行分子检测，其余均要进行BRAF突变状态的检测，对于阳性的需进行甲状腺全切及中央区淋巴结清扫，阴性的进行甲状腺全切即可。

图四  美国内分泌年会推荐甲状腺FNAB诊断方案

五、检测总结

六、检测注意事项及流程

穿刺样本应立即放入组织保存液并尽快送至实验室，12000转离心3min收集细胞，使用组织/胸水样本DNA分离试剂盒提取DNA，进行后续的检测。（病理科）